Автоматизация Автоматизация Архитектура Астрономия Одит Биология Счетоводство Военна наука Генетика География Геология Държавна къща Друга журналистика и средства за масова информация Изкуство Чужди езици Компютърни науки История Компютри Компютри Кулинарна култура Лексикология Литература Логика Маркетинг Математика Механика Механика Мениджмънт Метал и заваръчна механика Музика Население Образование Безопасност на живота Охрана на труда Педагогика Политика Право инструмент за програмиране производство Industries Психология P Дио Религия Източници Communication Социология на спорта стандартизация Строителство Технологии Търговия Туризъм Физика Физиология Философия Финанси Химически съоръжения Tsennoobrazovanie скициране Екология иконометрия Икономика Електроника Yurispundenktsiya

Цитогенетичен метод

Прочетете още:
  1. Етап I Подготовка за развитието на гръдния тип дишане по традиционния метод
  2. I. ГИМНАСТИКА, ТЕХНИТЕ ЗАДАЧИ И МЕТОДИЧНИ ХАРАКТЕРИСТИКИ
  3. I. Методическа основа
  4. I. Методологични основи на оценка на ефективността на инвестиционните проекти
  5. I. Предмет и метод на теоретичната икономика
  6. I. Какво изучава икономиката. Предметът и методът на икономиката.
  7. II. Метод за предварително изтегляне
  8. II. МЕТОДИЧЕСКИ ИНСТРУКЦИИ ЗА САМОСЪОБРАЗНАТА РАБОТА
  9. II. Методи за индиректна остеосинтеза.
  10. II. Проблемът за източника и метода на познанието.
  11. II. Пазарни методи.
  12. II. ОБРАЗОВАТЕЛНА И МЕТОДИЧНА КАРТА НА ДИСЦИПЛИНАТА

Теоретична част. Цитологичният метод се основава на микроскопско изследване на хромозомите в човешките клетки. Цитогенетичният метод се използва широко от 1956 г., когато J. Tio и L. Levan установиха, че в човешкия кариотип има 46 хромозоми.

Цитогенетичният метод се основава на данни за хромозомите. През 1960 г. на научна конференция в Денвър беше прието класифицирането на идентифицираните хромозоми, според което им се даваше число, увеличавайки се с намаляващи размери на хромозомите. Тази класификация е усъвършенствана на конференция в Лондон (1963 г.) и Чикаго (1966 г.).

Използването на цитогенетичния метод позволява да се изследва нормалната морфология на хромозомите и кариотипа като цяло, да се определи генетичния пол на организма и най-важното да се диагностират различни хромозомни заболявания, свързани с промени в броя на хромозомите или с разпадане в структурата на хромозомите. Цитогенетичният метод дава възможност да се изследват процесите на мутагенеза на нивото на хромозомите и кариотипа. Методът се използва широко в медицинското генетично консултиране за пренатална диагностика на хромозомни заболявания.

В човешките соматични клетки, диплоиден набор от хромозоми, 2n = 46, и в сексуален - хаплоид n = 23. При оплождане се възстановява диплоидният набор от хромозоми.

В хромозомата се идентифицират къси (р) и дълги (q) рамене. Краищата на двете ръце на хромозомата се наричат ​​теломери. В метафазата на митозата, хромозомите се представят от двама сестрински хроматиди, свързани с центрометрия. Центромерът съдържа вещество - кинетохоре, което участва в образуването на вретенови нишки в клетъчното делене.

При изучаване на кариотипа се определят следните морфометрични характеристики на хромозомите: L a - абсолютна дължина на хромозомата в μm; L p е дължината на късата ръка; L g е дължината на дългата ръка. I c е индексът на рамото, I c е центраметричният индекс, L r е относителната дължина на хромозомата, I h е процентът на хетерохроматичната зона, I s е спираловидният индекс.

Стойността на индекса на рамото определя формата на хромозомите. В I в 1-1,9 хромозомата се нарича равностранен (метацентричен), 2-4,9 - слабо неравният (субметоцентричен), 5 или повече - акроцентричен или рязко неравен.

За кариотипизиране метафазните плаки се избират в количество не по-малко от 30 със същия индекс на спирализация.



Въз основа на различията в дължината са изолирани 23 двойки хромозоми. Съгласно формата в човешкия кариотип има метацерични, субметометрични и акроцентрични хромозоми. Назначаването на хромозоми за определена група се основава на изчисляването на центрометричния индекс. Въз основа на размера и комбинацията на индексите на брахиалната и центромеровата индекси на човешката хромозома в съответствие с Международната класификация на Денвър (1960) те се групират в 7 групи, обозначени с буквите на английската азбука: A, B, C, D, E, F, G.

Таблица 1 Международна класификация на човешките хромозоми в Денвър (1960 г.).

Групата Брой на двойка хромозоми Центромерен индекс Размери и форма на хромозомите
А 0,48-0,49 Най-големият метацентър
0,38-0,40 Най-големият метацентър
0,45-0,46 Най-големият метацентър
B 4.5 0,24-0,30 Голям, субметометричен
C 6-12 X хромозома 0,28-0,43 Средно големи, метацентрични и субметометрични. Групата включва 7 автозома и X хромозома
D 13, 14, 15 до 0,15 Среден, акроцентричен, характеризиращ се с междуиндивидуална вариабилност и наличие на спътници на къси рамена
E 16-18 0,26-0,40 Сравнително къси метацентрични и субметометрични
F 19,20 0,36-0,46 Малки металокерамики
G 21.22 Y - хромозома 0,13-0,33 Малки акроцентрове. Автозомите се характеризират с наличието на сателити, които не са с къси ръце

Понастоящем идентификацията на хромозомите в съответствие с номенклатурата ISCN-1995 (Парижката номенклатура) все по-често използва диференциално оцветяване, което на хромозомите създава напречни ивици, благодарение на които е възможно по-точно да се идентифицират двойки хомолози.

Анализът на кариотипа се извършва в културата на разделяне на соматичните и половите клетки. Културата на клетките на периферната кръв, главно лимфоцити, костен мозък и фибробласти, се използва най-често. Различни клетъчни култури се използват за анализиране на кариотипа на фетуса; техният избор се определя от периода на бременност (до 12 седмици - при използване на клетки от вирий, по-късно - фетални клетки, изолирани от амниотична течност, пъпна връв и плацента).

‡ Зареждане ...

Цитологичният анализ включва три основни етапа:

1) култивиране на клетки;

2) оцветяване на препарата;

3) Микроскопски анализ на препарата.

Отглеждане. Пробата се поставя в хранителна среда с добавка на цяла суроватка от говеда и протеин от бобови растения - фитохемаглутинин, стимулиращ процеса на клетъчно делене. За да се увеличи броят на метафазните клетки (кариотипът се изследва в метафазните клетки, където хромозомите достигат най-високата спирала и техните форми се проявяват най-ясно), колхицин (C22H25NO6) се въвежда в културата 1,5 часа преди края на култивацията, която разрушава клетъчния шпиндел, спира разделянето на клетките на етапа на метафазата и увеличава кондензацията (спирализация) на хромозомите. Обикновено отглеждането е 72 часа. След това клетките се разделят чрез центрофугиране и поставяне в хипотоничен разтвор на калиев хлорид или натриев цитрат. В хипотоничната среда ядрената обвивка и междухромозомните връзки се разкъсват и хромозомите свободно се преместват в цитоплазмата. След това клетките се фиксират в фиксатор на Carnoy (3: 1): 3 части са 96% етилов алкохол, 1 част ледена оцетна киселина.

След фиксиране клетъчната суспензия се разстила на обезмаслени, охладени мокри стъкла и се суши на въздух.

Оцветяване. Най-простият метод за оцветяване на хромозоми е непрекъснат метод според Giemsa. Твърдият цвят се използва за определяне на броя на хромозомите, за идентифициране на геномни мутации и анеуплоиди.

За да се идентифицира структурното пренареждане на хромозомите (хромозомни мутации), се използва различен цвят, в резултат на което хромозомите придобиват напречна ивица. Местоположението и дължината на тъмните и светлите ленти са строго индивидуални за всяка хромозома, така че е възможно по-точно да се идентифицират хомоложните двойки и да се идентифицират хромозомните пренареждания.

G-методът на диференциално оцветяване е най-ефективен, за това можете да използвате Giemsa багрило, след предварително третиране на хромозомите с разтвор на трипсин. С това оцветяване броят на лентите върху хромозомите в метафазните пластини достига 400. За Diphokraski се използват R-методът и Q-методът. След боядисването, обектът е затворен в канадски балсам, лекарството става постоянно и може да се съхранява в продължение на десетилетия.

Микроскопия на метафазните хромозомни препарати. За описване на човешкия кариотип се използва универсална схема и специални символи. Например вписване 46, xx - показва нормален кариотип на жена и 46, xy - нормален кариотип на мъж.

В много случаи при изучаване на хромозоми се установява, че полиморфизмът е най-характерният за акроцентричните хромозоми и като правило отразява хетерогенността на хетерохроматичните сегменти, наличието на спътници, спътникови направления в района на къси ръце и тяхната величина. Таблица 2 показва някои от тях.

Таблица 2 Определяне на полиморфизма на човешките хромозоми

Кариотипни символи Тип хромозомно прегрупиране
46, XX, 9qh + Увеличаване на размера на мястото на хетерохроматина в дългата ръка на хромозомата 9 жени
46, XY, Yqh- Намаляване на размера на хетерохроматинната област на дългата ръка на Y хромозомата при мъжете
46, XX, 22ps + Увеличаването на размера на спътниците на късата ръка на хромозома 22 при жена
46, XY, 21pstk Увеличаването на дължината на сателитните нишки на късата ръка на хромозома 21 при човек
46, XX, fra (16) (р21.3) Счупено място в сегмент 21 на дългата ръка на хромозома 16
46, XX, 15pss Появата на двойни сателити на късата ръка на хромозома 15 при жена
46, XX, 21ps + Увеличаване на размера на спътниците на късата ръка на хромозома 21 при жените

Установено е, че наличието на нормален хромозомен полиморфизъм увеличава риска от това дете да има хромозомни аномалии.

Сред двойките, които са имали деца с малформации, както и тези с безплодие и обичайните спонтанни аборти, по-често се открива пренасяне на хромозоми с големи хетерохроматинови блокчета. Преобладаването на индивиди с увеличени хетерохроматинови сегменти в акроцентрични хромозоми, както и хромозоми 1, 9 и 16 е наблюдавано при групата с деца с множествени вродени малформации.

Следвайки препоръките на IV Международен конгрес по човешка генетика в Париж (1971), когато се описват допълнителни хромозоми, техният брой се поставя след общия брой на автозомите и половите хромозоми с знак плюс или минус преди броя на заместената автозома. Например, записът (формула) 47, XX + 21 означава кариотип на жена с тризомия над 21 чифта хромозоми. Напротив, кариотипът на човек с екстрахромозома X е изобразен като 47, XXY. Знакът "плюс" или знак "минус" се поставя след символа на хромозомата, за да покаже удължението или съкращаването на рамото му. Писмото q символизира дългото рамо и p - късата. Например, запис 46, XY, 1q + показва увеличение на дългото рамо на хромозома 1. Формула 47, XY + 14p + е кариотип на човек с 47 хромозома, включително допълнителна хромозома 14 с удължение на късата си ръка.

Съкращението е def (def), dup (дублиране), r (пръстен, възникващ след обединението на две прекъсвания в хромозомата), inv (инверсия) и t (транслокация). Числата на хромозомите или хромозомите се поставят след съкращенията в скоби. Например вписванията 46, XX, r (18) означават кариотипа на жена с 46 хромозома, включително r-хромозомата 18. Формула 46, X, inv (Xq) е кариотип на жена с 46 хромозома, включително една нормална X хромозома и X хромозома с две генетично идентични дълги рамена). Бандите са маркирани с номера, тъй като се отдалечават от центромерите по късите (р) и дългите (q) рамене на хромозомата.

С помощта на цитогенетичния метод са идентифицирани хромозомни мутации като реципрочни транслокации, Роберцонски транслокации и заличавания. По този начин транслокацията на 21-ия хромозом към друг 21, 22, 13, 14 или 15 причинява синдром на Даун. По този начин, заличаването на късото рамо на X хромозомата (тълкувано като X хромозомна монозомия) скъсява късата ръка на 21-ия хромозом (Филаделфийска хромозома), заличаването на късата рамо на хромозомата на петата двойка (синдром на котешки писъци), заличаването на дългата и късата ръка 18-ия хромозом (нарушение на структурата на лицето, скелет, умствена изостаналост, хипотрофия, хипотония и много други аномалии). В резултат на двата терминални недостатъка се образуват пръстеновидни хромозоми. При 5-ия хромозом на пръстена се развива синдром на "котешки писък", в х-хромозомата - клиничната картина е подобна на синдрома на Шерешенски-Търнър. Сред геномните мутации, най-често срещан е синдром на Даун (тризомия 21 двойки). Тризомията на хромозома 13 причинява синдром на Patau, на 18 хромозоми - синдром на Едуардс. Сред анеуплоидните синдроми на половите хромозоми (CW) е синдромът на Shershevsky-Turner. Полизомията върху X хромозомата се нарича синдром на Клайнфелтер (XXY), се наблюдават отклонения в броя на половите хромозоми (XXXY, XYY и т.н.) и синдром на TriploH.

Метод за определяне на сексуален хроматин. Това е експресен метод, който позволява да се открият промени в броя на половите хромозоми в неразделителните клетки на лигавицата на бузата. Сексът хроматин или тялото на Бара се образува от една от хромозомите на женското тяло. Прилича на силно оцветена купчина, разположена близо до ядрения плик. С увеличаване на броя на X хромозомите в кариотипа на тялото, телата на Barra се формират в количество по-малко от броя на X хромозомите. При монозомия върху хромозомата X, тялото на Бара липсва. Y-хромозомата в мъжкия кариотип се открива чрез по-интензивна луминисценция, когато се лекува с акрихиниприт и лъчение в ултравиолетова светлина.

Задание 1.

Проучете лекциите и материалите на учебниците.

Задание 2.

Запишете в речника и научете основните термини и концепции: хромозома, рамото на хромозомата, центромерът (кинетохоре), хромозомните разлики във формата (метацентрично, субметоцентрично, акроцентрично), проксималния, дисталния и теломерния рамен сегмент, хромозома, дизоксирибонуклеопротеините (DNP): еххроматин, хетерохроматин, метафазна плака. Кариотип, хомоложни хромозоми, изохромозоми, кариограма, идиограма, морфометрични параметри (абсолютна хромозомна дължина, брахиален индекс, центрометричен индекс, относителна дължина, процент хетерохроматична зона, спирален индекс, нуклеозом, нуклеозомна нишка, елементарен хроматин фибрил, интерфазен хромонем, метафазен хроматид, хромозомни, хромозомни видове тръбни четки, хаплоиден набор от хромозоми, диплоиден набор от хромозоми, полови хромозоми, автозоми, В хромозоми.

Задание 3.

Изчертайте структурата на метафазната хромозома, сателитната хромозома, политеновата хромозома, хромозомата, като например четките за лампи.

Задание 4.

Преброявайте броя на хромозомите в метафазната пластина. Изградете идиограма (според инструкциите на учителя) въз основа на единната номенклатура.

Задание 5.

Измерете абсолютната дължина и раменете на хромозомите (в mm) и запишете данните в таблица 3.

Таблица 3.

Параметри на хромозомите

Брой двойки хомоложни хромозоми Хромо-сома в двойката (1, 2) Дължина в mm L h дължина на хетерохроматора Забележка-ТА
Общо L a Дълга рамо, L p Кратко рамо, L q
аз

Броят редове в таблицата трябва да съответства на броя на хромозомите на изследваното кариотип.

Задача 6.

Изчислете индекса на спиралата I и стойностите на морфометричните параметри L a , I r , I b , I c , I h и ги постави в таблица 2.

Абсолютната дължина на най-очевидната хромозома (наречена тест) на хромозомата се измерва чрез микроскопия, като се използва микрометър на окуляра и се изразява в μm. След това хромозомният фактор на увеличение се изчислява на снимката на метафазната плака и след това чрез коефициента на увеличение се изчислява абсолютната дължина на всяка хромозома на кариотипа. Например, дължината на тестовата хромозома La 1.1 на снимката е 27 mm или 27 × 1000 μm, физическата или абсолютната дължина на една и съща хромозома L a 1.1 е 10,5 μm, тогава увеличението ,

В нашия пример , Освен това, например, L a '1,2 = 26,5 mm. , L a , изразени в μm, са записани в таблица 4.

% ; , , Аз съм се изчислява като съотношението на сумата от абсолютната дължина на 2 най-къси хромозоми до сумата от абсолютната дължина на двата най-дълги хромозома.

Таблица 4.

Основни морфометрични параметри на хромозомите

Група, брой двойки хомоложни хромозоми Хромо-сома двойка в чифт L а μm I r ,% I b Аз в Аз,%
аз

Броят редове в таблицата трябва да съответства на броя на хромозомите на изследваното кариотип.

Задача 7.

Анализирайте данните на идиограми и таблици, като използвате идеи за морфологичното сходство на хомоложните хромозоми и техния брой в кариотипа.

Направете заключение относно резултатите от извършената работа.

Задача 8.

Отговорете на въпросите за самооценка:

1. Отворете понятието кариотип, кариограма, идиограма.

2. Какъв е химическият състав, структурата и морфологията на хромозомите.

3. Каква е съдържанието на цитогенетичния метод, какви са неговите възможности.

4. Каква е значимостта на дифузията на хромозомите.

5. Опишете степента на опаковане на ДНК в метафазната хромозома (нуклеозом, нуклеозомна нишка, хромонема).

6. Опишете различните видове хромозоми.

7. Дайте примери за хромозомни и геномни мутации при хора.

Дейност 9.

В нормален човешки кариотип има 44 автозоми и 2 полови хромозоми (XX или XY). В случая на истински хермаптодизъм (едновременно мъжки и женски сексуални жлези в индивид), в тялото се откриват два клона от клетки, различаващи се в състава на половите хромозоми (XX / XY).

а) Направете символичен запис на нормален кариотип на жена и мъж.

б) Запишете кариотип на човек с истински хермафродизъм.

Задача 10.

Направете декодиране на кариотипите на болните хора: 1) 47, XY, + G; 2) 46, XX, 1р +; 3) 46, XY, 14q-; 4) 47, XX, + 14р +; 5) 46, XX, del (1) (q21); 6) 46, XY, t (2; 5) (q21; q31); 7) 46, XX, r (18). Забележка: del - deletion, t - транслокация, г - пръстенна хромозома.

Задача 11.

Колко тела на пола на хроматина могат да бъдат намерени в повечето междуфазови клетки на хора с кариотипове: 1) 46, XX; 2) 46, XY; 3) 47, XXY; 4) 48, XXXY; 5) 45, X; 6) 47, XXX; 7) 48, XXXX; 8) 49, XXXXX?

Формуляр за отчета:

- представяне на проверено копие на бележника и устна защита на произведението;

- Извършете тест. Работата по изучаването на кариотипа трябва да бъде формализирана като отделна задача.


1 | | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |


Когато използвате този материал, свържете се със bseen2.biz (0.105 сек.)